The Robia Lab - Julkaisut (2023)

Robia-laboratorion tutkijat työskentelevät erilaisissa projekteissa, jotka keskittyvät proteiinien rakenteen ja toiminnan välisiin suhteisiin ja molekyylifysiologiaan.

Tärkeimmät biologiset teemat on tiivistetty alla tai tutustu meidän täydellinen luettelo julkaisuista.

Kuljetus-ATPaasien sääntelevät vuorovaikutukset

Kalvoproteiinien proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia on vaikea kvantifioida perinteisillä biokemiallisilla lähestymistavoilla, kuten yhteisimmunosaostuksella tai SPR:llä. Nämä tavanomaiset menetelmät vaativat pesuaineen liuottamista, mikä voi häiritä fysiologisesti tärkeitä vuorovaikutuksia. Tämän esteen kiertämiseksi olemme kehittäneet menetelmiä kuljetus-ATPaasi-säätelyvuorovaikutusten affiniteetin kvantitoimiseksi elävien solujen kalvon alkuperäisessä ympäristössä. Nämä FRET-pohjaiset määritykset paljastavat myös tietoa proteiinikompleksin kvaternaarisesta rakenteesta. Olemme keskittyneet P-tyypin kuljettajiin, mukaan lukien SERCA1a, SERCA2a ja natriumkuljettaja NKA. Olemme löytäneet uusia determinantteja näiden kuljettajien toiminnalliselle modulaatiolle peptidisäätelijöillä ja kvantifioineet, kuinka nämä säätelyvuorovaikutukset viritetään PKA/PKC:n fosforylaatiolla.

• 1. Blackwell DJ, Zak TJ, Robia SL. Sydämen kalsiumin ATPaasin dimerointi mitattuna silloituksella ja fluoresenssienergian siirrolla.Biophys J. 2016;111(6):1192-202. doi: 10.1016/j.bpj.2016.08.005. PubMed PMID: 27653478; PMCID: PMC5034344.

  2. Soller KJ, Verardi R, Jing M, Abrol N, Yang J, Walsh N, Vostrikov VV, Robia SL, Bowser MT, Veglia G. SERCA/Phospholamban Membrane Protein Complexin reostaattinen säätely käyttämällä ei-koodaavaa RNA:ta ja yksijuosteisia DNA-oligonukleotideja.Sci Rep. 2015;5:13000. doi: 10.1038/srep13000. PubMed PMID: 26292938; PMCID: PMC4543939.

  3. Abrol N, Smolin N, Armanious G, Ceholski DK, Trieber CA, Young HS, Robia SL. Fosfolambaani C-terminaaliset tähteet ovat kriittisiä kalsiumin ATPaasin säätelykompleksin rakenteen ja toiminnan määrääviä tekijöitä.J Biol Chem. 2014;289(37):25855-66. doi: 10.1074/jbc.M114.562579. PubMed PMID: 25074938; PMCID: PMC4162186.

  4. Ha KN, Masterson LR, Hou Z, Verardi R, Walsh N, Veglia G, Robia SL. Tappava Arg9Cys-fosfolambaanimutaatio estää proteiinikinaasi A:n Ca2+-ATPaasin säätelyä ja fosforylaatiota.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United of America. 2011;108(7):2735-40. Epub 2.2.2011. doi: 10.1073/pnas.1013987108. Julkaistu PMID: 21282613; PMCID: 3041113.

Kuljetus-ATPaasien konformaatiodynamiikka

Robia-laboratorion pääpaino on ollut kalvokuljetuksen rakenteellinen perusta. Osa tästä ponnistelusta on sisältynyt "2-värin kuljettaja"-rakenteiden kehittämiseen ja käyttöön, uusia antureita, jotka raportoivat muutoksista ATPaasi-konformaatiossa muuttuneella molekyylinsisäisellä FRET:llä. Niillä on sovelluksia rakennetutkimuksiin, ja ne ovat hyödyllisiä lääkekirjastojen suuren suorituskyvyn seulonnassa. Yhdistämällä nämä uudet työkalut kehittyneisiin spektroskooppisiin menetelmiin ja molekyylidynamiikan simulaatioihin olemme pystyneet paljastamaan tuntemattomia entsymaattisia alatiloja. Olemme kvantifioineet mikrosekunnin/millisekunnin liikkeet ja tunnistaneet erilliset rakenneosat, jotka ovat tärkeitä kuljettajan toiminnalle. Nämä tärkeät toiminnalliset tekijät eivät ole käytettävissä perinteisillä rakennebiologian lähestymistavoilla, kuten röntgenkristallografialla. Yhdessä yhteistyökumppaneidemme kanssa olemme tehneet suuren suorituskyvyn seulonnan ja löytäneet uusia pieniä molekyylejä, jotka muuttavat kuljettajan rakennetta ja toimintaa. Tämä meneillään oleva projekti etsii lääkekandidaatteja, jotka voivat olla hyödyllisiä ihmisten sairauksien uusien hoitomuotojen kehittämisessä. Olemme myös toteuttaneet molekyylidynamiikan simulaatioita ATPaasin konformaatiomuutoksia koskevissa tutkimuksissamme. Simulaatiotulosten vertailu fysikaalisten kokeiden (fluoresenssispektroskopia) tietoihin mahdollistaa solufysiologisissa ympäristöissä tehtyjen mittausten tulkitsemisen korkearesoluutioisen rakenneinformaation kontekstissa.

• 1. Iram SH, Gruber SJ, Raguimova ON, Thomas DD, Robia SL. ATP:tä sitovan kasetin kuljettajan rakennemuutokset, jotka havaittiin molekyylinsisäisellä fluoresenssienergiansiirrolla korkean suorituskyvyn seulontaa varten. Molekyylifarmakologia. 2015;88(1):84-94. Epub 2015/05/01. doi: 10,1124/mol.114,096792. Julkaistu PMID: 25924616.

  2. Gruber SJ, Cornea RL, Li J, Peterson KC, Schaaf TM, Gillispie GD, Dahl R, Zsebo KM, Robia SL, Thomas DD. Entsyymimodulaattoreiden löytäminen elävien solujen korkean suorituskyvyn aikaresoluutioisen FRETin avulla. J Biomol -näyttö. 2014;19(2):215-22. Epub 18.1.2014. doi: 10.1177/1087057113510740 19/2/215 [pii]. PubMed PMID: 24436077. (kansiartikkeli).

  3. Hou Z, Hu Z, Blackwell DJ, Miller TD, Thomas DD, Robia SL. 2-värinen kalsiumpumppu paljastaa sytoplasmisen pääkappaleen sulkeutumisen ja kalsiumin sitoutumisen.PLoS One. 2012;7(7):e40369. Epub 19.7.2012. doi: 10.1371/journal.pone.0040369 PONE-D-12-07470 [pii]. PubMed PMID: 22808146; PMCID: 3394785.

  4. Song Q, Pallikkuth S, Bossuyt J, Bers DM, Robia SL. Fosfomimeettiset mutaatiot tehostavat fosfolemmanin oligomerisaatiota ja moduloivat sen vuorovaikutusta Na/K-ATPaasin kanssa.J Biol Chem. 2011; 286(11):9120-6. Epub 12.1.2011. doi: 10.1074/jbc.M110.198036 [pii]. Julkaistu PMID: 21220422; PMCID: 3059012.

Patogeneesin rakenteelliset mekanismit

Robia-laboratorio on käyttänyt fluoresenssikuvausta ja laskennallisia lähestymistapoja patogeenisten mutaatioiden tutkimiseen ja paljastanut uutta tietoa ihmisten sairauksien perusmekanismeista. Me ja yhteistyökumppanimme olemme tutkineet proteiineja, jotka liittyvät erilaisiin sairauksiin, mukaan lukien lihasdystrofia, verisuonisairaus, sydänsairaus, tartuntatauti ja syöpä.

• 1. [ PMC ilmainen artikkeli ] [ PubMed ] Lamichhane R, Mukherjee S, Smolin N, Pauszek RF, 3rd, Bradley M, Sastri J, Robia SL, Millar D, Campbell EM. Dynaamiset konformaatiomuutokset rhesus-TRIM5alpha-dimeerissä sanelevat HIV-1-restriktion voimakkuuden. Virologia. 2017;500:161-8. doi: 10.1016/j.virol.2016.10.003. Julkaistu PMID: 27821283; PMCID: PMC5327651.

  2. Dvornikov AV, Smolin N, Zhang M, Martin JL, Robia SL, de Tombe PP. Restriktiivinen kardiomyopatia Troponin-I R145W -mutaatio ei häiritse myofilamentin pituudesta riippuvaa aktivaatiota ihmisen sydämen sarkomeereissä. J Biol Chem. 2016. doi: 10.1074/jbc.M116.746172. Julkaistu PMID: 27557662.

  3. Abrol N, Tomb PP, Robia SL. Fosfolambaanin kardiomyopaattisen R9C-mutaation akuutit inotrooppiset ja lusitrooppiset vaikutukset. J Biol Chem. 2015;290(11):7130-40. Epub 17.1.2015. doi: 10.1074/jbc.M114.630319. PubMed PMID: 25593317; PMCID: 4358133.

  4. Sastri J, Johnsen L, Smolin N, Imam S, Mukherjee S, Lukic Z, Brandariz-Nunez A, Robia SL, Diaz-Griffero F, Wiethoff C, Campbell EM. Rhesus TRIM5alpha HIV-1:n rajoittamista hallitsevat alfaheliksit Linker2-alueella. J Virol. 2014;88(16):8911-23. doi: 10.1128/JVI.01134-14. PubMed PMID: 24872590; PMCID: PMC4136267.

Transmembraanisten peptidien oligomerointi

Kuljetus-ATPaasien aktiivisuutta moduloidaan usein epäsuorasti säätelevien kumppaneiden sekvestroinnin kautta homooligomeerisiksi komplekseiksi. Olemme käyttäneet fluoresenssimikroskopiaa ja spektroskopiaa näiden kalvoproteiinioligomeerien affiniteetin, stoikiometrian ja kvaternaarisen konformaation kvantifiointiin. Olemme kehittäneet uuden menetelmän oligomeerista peräisin olevien protomeerien vaihtonopeuksien kvantifioimiseksi.

• 1. Autry JM, Rubin JE, Pietrini SD, Winters DL, Robia SL, Thomas DD. Sarkolipiinin ja Ca-ATPaasin oligomeeriset vuorovaikutukset. Biologisen kemian lehti. 2011;286(36):31697-706. Epub 2011/07/09. doi: 10.1074/jbc.M111.246843. Julkaistu PMID: 21737843; PubMed Central PMCID: PMC3173058.

  2. [ PubMed ] Zhao W, Wagoner JR, Zhang ZG, Lam CK, Han P, Qian J, Schroder PM, Mitton B, Kontrogianni-Constantopoulos A, Robia SL, Kranias EG. Anti-apoptoottinen proteiini HAX-1 on sydämen toiminnan säätelijä. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United of America. 2009;106(49):20776-81. Epub 19.11.2009. doi: 10.1073/pnas.0906998106. Julkaistu PMID: 19920172; PubMed Central PMCID: PMC2791603.

  3. Robia SL, Campbell KS, Kelly EM, Hou Z, Winters DL, Thomas DD. Forsterin siirron palautuminen paljastaa, että fosfolambaani vaihtuu hitaasti pentameereistä mutta nopeasti SERCA-säätelykompleksista.Kiertotutkimus. 2007;101(11):1123-9. Epub 2007/11/03. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.107.159947. Julkaistu PMID: 17975108; PubMed Central PMCID: PMC2590498. (kansiartikkeli)

  4. Robia SL, Flohr NC, Thomas DD. Fosfolambaanipentameerin kvaternäärinen konformaatio määritetty geelin sisäisellä fluoresenssianisotropialla. Biokemia. 2005;44(11):4302-11. Epub 2005/03/16. doi: 10.1021/bi0478446. Julkaistu PMID: 15766259.

Proteiinikinaasisignaloinnin biofysiikka

Proteiinikinaasispesifisyyden avaintekijä on kinaasin subsellulaarinen sijainti lähellä kohdesubstraattia. Kinaasien lokalisoituminen on säädelty prosessi, ja kinaasiaktivaatioon liittyy usein proteiinin siirtyminen yhdeltä subsellulaarisesta alueesta toiselle. Olemme käyttäneet fluoresenssimikroskopiaa tarkkailemaan tätä translokaatiota ja kvantifioimaan tärkeitä parametreja, kuten sitoutumisen/sitoutumisen kinetiikkaa. Olemme löytäneet uusia rakenteellisia elementtejä, jotka määräävät kinaasikohdistuksen ja translokaationopeudet.

• 1. [ PubMed ] Koshman YE, Chu M, Engman SJ, Kim T, Iyengar R, Robia SL, Samarel AM. Fokaaliadheesion kinaasiin liittyvä nonkinaasi estää verisuonten sileän lihaksen solujen tunkeutumisen fokaalin adheesion kohdistamisella, tyrosiini 168:n fosforylaatiolla ja kilpailulla p130(Cas)-sitoutumisesta.Ateroskleroosi, tromboosi ja verisuonibiologia. 2011;31(11):2432-40. Epub 20.8.2011. doi: 10.1161/ATVBAHA.111.235549. Julkaistu PMID: 21852560; PubMed Central PMCID: PMC3197899.

  2. Bossuyt J, Chang CW, Helmstadter K, Kunkel MT, Newton AC, Campbell KS, Martin JL, Bossuyt S, Robia SL, Bers DM. Spatiotemporaalisesti erilainen proteiinikinaasi D:n aktivaatio aikuisten sydänlihassoluissa vasteena fenyyliefriinille ja endoteliinille.Biologisen kemian lehti. 2011;286(38):33390-400. Epub 29.7.2011. doi: 10.1074/jbc.M111.246447. PubMed PMID: 21795686; PMCID: PMC3190922.

  3. [ PubMed ] Koshman YE, Kim T, Chu M, Engman SJ, Iyengar R, Robia SL, Samarel AM. FRNK estää fokaalista adheesiokinaasista riippuvaa signalointia ja migraatiota verisuonten sileissä lihassoluissa.Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010 marraskuu;30(11):2226-33. PubMed PMID: 20705914; PubMed Central PMCID: PMC4058887

  4. Robia SL, Ghanta J, Robu VG, Walker JW. Proteiinikinaasi C-epsilonin ankkuroitumisen lokalisointi ja kinetiikka sydämen myosyytteihin.Biofyysinen lehti. 2001;80(5):2140-51. Epub 28.4.2001. doi: 10.1016/S0006-3495(01)76187-5. Julkaistu PMID: 11325717; PubMed Central PMCID: PMC1301406.