Fosfolambaanin toiminnan ja ilmentymisen molekyylisäätely (2023)

Retinoiinihapporeseptori (RAR) on osallisena patologisten ärsykkeiden aiheuttamassa sydämen uudelleenmuodostumisessa. Sen määrittämiseksi, vaikuttaako RARa-signaloinnin heikkeneminen suoraan sydämen toimintahäiriön ja siihen liittyvien mekanismien kehittymiseen, käytettiin tamoksifeenin aiheuttamaa sydänlihasspesifistä RARa-deleetiota (RARaKO) -hiiriä. Ekokardiografiset ja sydämen katetrointitutkimukset osoittivat merkittävää diastolista toimintahäiriötä 16 viikon geenideleetion jälkeen. Merkittäviä eroja ei kuitenkaan havaittu vasemman kammion ejektiofraktiossa (LVEF) RARaKO- ja villityypin (WT) kontrollihiirten välillä. DHE-värjäys osoitti lisääntynyttä solunsisäisten reaktiivisten happilajien (ROS) muodostumista RARαKO-hiirten sydämissä. Merkittävästi kohonneita NOX2- (NADPH-oksidaasi 2)- ja NOX4-tasoja ja alentuneita SOD1- ja SOD2-tasoja havaittiin RARaKO-hiiren sydämissä, jotka pelastettiin RARa:n yli-ilmentymisellä kardiomyosyyteissä. Vähentynyt SERCA2a:n ilmentyminen ja fosfolambaanin (PLB) fosforylaatio sekä Akt:n ja Ca:n vähentynyt fosforylaatio²⁺/kalmoduliinista riippuvainen proteiinikinaasi II 8 (CaMKII 8) havaittiin RARaKO-hiiren sydämissä. Ca²⁺RARa-deleetio viivästytti takaisinottoa ja kardiomyosyyttien rentoutumista. RARa:n yli-ilmentyminen tai ROS-muodostuksen tai NOX-aktivaation estäminen esti RARa-deleetion aiheuttaman SERCA2a:n ilmentymisen/aktivaation vähenemisen ja viivästyneen Ca:n²⁺takaisinotto. Lisäksi RARa:n geeni- ja proteiiniekspressio väheni merkittävästi ikääntyneissä tai metabolisesti stressaantuneissa hiiren sydämissä. RARa-deleetio kiihdytti diastolisen toimintahäiriön kehittymistä streptotsotosiinilla (STZ) indusoiduilla tyypin 1 diabeettisilla hiirillä tai runsaasti rasvaa saaneilla ruokavaliolla ruokituilla hiirillä. Yhteenvetona voidaan todeta, että sydänlihaksen RARa-deleetio edisti diastolista toimintahäiriötä suhteellisen säilyneen LVEF:n kanssa. Lisääntyneellä oksidatiivisella stressillä on tärkeä rooli SERCA2a:n ja Ca:n vähentyneessä ilmentymisessä/aktivaatiossa²⁺virheellinen käsittely RARαKO-hiirillä, jotka ovat merkittäviä myötävaikuttavia tekijöitä diastolisen toimintahäiriön kehittymisessä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että sydämen RARa-signaloinnin heikkeneminen voi olla uusi mekanismi, joka liittyy suoraan patologisten ärsykkeiden aiheuttamaan diastoliseen toimintahäiriöön.

Fosfolambaani (PLN) säätelee sydämen sarko- (endo)plasmaverkkoa Ca²⁺-ATPaasi (SERCA2a) Ser¹⁶-fosforylaatio. Sydämen vajaatoiminnan aikana PLN:n ilmentyminen vähenee SERCA2a:lla; sen säätelymekanismia ei kuitenkaan täysin ymmärretä. Fosforylaatio laukaisee proteiinien hajoamisen, ja koska PLN-fosforylaatio lisääntyy heikossa sydämessä, tutkimme, hajottaako Ser PLN.¹⁶-fosforylaatio. Solut, jotka yliekspressoivat PLN:tä, osoittivat sen hajoamista isoproterenolin (Iso), forskoliinin tai 3-isobutyyli-1-metyyliksantiinin (IBMX) lisäyksen jälkeen. Lisäksi cAMP-riippuvainen proteiinikinaasin (PKA) inhibiittori – H89 esti tätä hajoamista. Yhteisimmunosaostus paljasti, että Lys³PLN:stä oligo-ubikvitinoitunut, kun ubikitiini oli yli-ilmentynyt, ja se hajosi Iso-käsittelyllä. Kuitenkin, kun sitä ilmennetään yhdessä SERCA2a:n kanssa, oligoubikvitoitunut PLN Lysissä³ei heikentynyt Iso-käsittelyllä. 16 viikon ikäisen TgPLN:n vajaatoiminnan sydämissä^R9Chiirillä oligo-ubikvitinoidut PLN-tasot nousivat ja PLN-ilmentyminen väheni. Lisäksi SERCA2a-mRNA-tasot TgPLN:ssä^R9Chiirten sydämet olivat alhaisemmat kuin villityypin hiirillä; PLN-mRNA-tasot eivät kuitenkaan osoittaneet muutoksia. Toisessa sydämen vajaatoimintamallissa MG132-hoito käänsi PLN:n hajoamisen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että PLN on ainakin osittain oligo-ubikvitinoitunut Lysissä³ja heikkeni Ser¹⁶-fosforylaatiovälitteinen polyubiquitinaatio sydämen vajaatoiminnan aikana.

Lihaksessa Sarco(Endo)plasmic Reticulum Calcium ATPase (SERCA) -aktiivisuutta säätelevät kaksi erillistä proteiinia, PLB ja SLN, jotka ovat erittäin konservoituneita läpi selkärankaisten evoluution. PLB ilmentyy pääasiassa sydänlihaksessa, kun taas SLN on runsaasti luurankolihaksessa. SLN:tä löytyy myös sydämen eteisestä ja vähemmässä määrin kammiosta. SERCA:n PLB-säätely on keskeistä sydämen toiminnalle sekä levossa että äärimmäisen fysiologisen tarpeen aikana. Verrattuna PLB:hen SLN:n fysiologinen merkitys pysyi mysteerinä viime aikoihin asti, ja jotkut jopa pitivät sitä toiminnaltaan tarpeettomana. SLN-tutkimukset viittaavat siihen, että se on SERCA-pumpun toiminnan irrottaja ja voi lisätä ATP-hydrolyysiä, mikä johtaa lämmöntuotantoon. Käyttämällä geneettisesti muokattuja hiirimalleja SLN:lle ja PLB:lle, osoitimme, että SLN, ei PLB, tarvitaan lihaspohjaiseen termogeneesiin. Kuitenkin mekanismi, jolla SLN:n sitoutuminen SERCAan johtaa SERCA Ca:n irrottamiseen²⁺kuljetus sen ATPaasi-aktiivisuudesta jää epäselväksi. Tässä katsauksessa käsittelemme viimeaikaisia ​​edistysaskeleita sen ymmärtämisessä, kuinka PLB ja SLN eroavat vuorovaikutuksessaan SERCA:n kanssa. Tutkimme myös, ovatko rakenteelliset erot PLB:n ja SLN:n sytosolisessa domeenissa perusta niiden ainutlaatuiselle toiminnalle ja fysiologisille rooleille sydän- ja luustolihaksissa.

Pieni ankyriini 1 (sAnk1) on 17 kDa:n transmembraaninen (TM) proteiini, joka sitoutuu sytoskeletaaliseen proteiiniin, obscuriiniin, ja stabiloi luustolihaksen sarkoplasmisen verkkokalvon. Raportoimme, että sAnk1 jakaa homologian TM-aminohapposekvenssissään sarkolipiinin kanssa, joka on sarko(endo)plasmisen retikulumin Ca:n pieni proteiini-inhibiittori.²⁺-ATPaasi (SERCA). Täällä tutkimme, ovatko sAnk1 ja SERCA1 vuorovaikutuksessa. Tuloksemme osoittavat, että sAnk1 on vuorovaikutuksessa spesifisesti SERCA1:n kanssa kanin luurankolihaksesta eristetyissä sarkoplasmisissa verkkorakkuloissa ja COS7-soluissa, jotka on transfektoitu ekspressoimaan näitä proteiineja. Tämä vuorovaikutus osoitettiin yhteisimmunosaostuksella ja anisotropiaan perustuvalla FRET-menetelmällä. Sitoutuminen väheni noin 2-kertaiseksi korvaamalla kaikki sAnk1:n TM-aminohapot leusineilla mutageneesillä. Tämä viittaa siihen, että sarkolipiinin tavoin sAnk1 on vuorovaikutuksessa SERCA1:n kanssa ainakin osittain sen TM-verkkotunnuksen kautta. Myös sAnk1:n sytoplasmisen domeenin sitoutuminen SERCA1:een havaittiinin vitro. ATPaasiaktiivisuusmääritykset osoittavat, että sAnk1:n yhteisilmentyminen SERCA1:n kanssa johtaa näennäisen Ca:n vähenemiseen²⁺SERCA1:n affiniteetti, mutta sAnk1:n vaikutus on pienempi kuin sarkolipiinin. sAnk1 TM -mutantilla ei ole vaikutusta SERCA1-aktiivisuuteen. Tuloksemme viittaavat siihen, että sAnk1 on vuorovaikutuksessa SERCA1:n kanssa sen TM- ja sytoplasmadomeenien kautta SERCA1-aktiivisuuden säätelemiseksi ja Ca:n sekvestroinnin moduloimiseksi²⁺sarkoplasmisen retikulumin luumenissa. sAnk1:n tunnistamisella uudeksi SERCA1:n säätelijäksi on merkittäviä vaikutuksia lihasfysiologiaan ja terapeuttisten lähestymistapojen kehittämiseen sydämen vajaatoiminnan ja Ca:hen liittyvien lihasdystrofioiden hoitoon.²⁺väärin säätelyä.

Funktionaaliset mikropeptidit voidaan piilottaa RNA:iden sisään, jotka näyttävät olevan koodaamattomia. Löysimme konservoituneen mikropeptidin, jonka nimesimme myoreguliiniksi (MLN), jota koodaa luurankolihasspesifinen RNA, joka on merkitty oletetuksi pitkäksi koodaamattomaksi RNA:ksi. MLN on rakenteellisesti ja toiminnallisesti samankaltainen fosfolambaanin (PLN) ja sarkolipiinin (SLN) kanssa, jotka estävät SERCA:ta, kalvopumppua, joka säätelee lihasten rentoutumista säätelemällä Ca²⁺imeytyminen sarkoplasmiseen retikulumiin (SR). MLN on suoraan vuorovaikutuksessa SERCA:n kanssa ja estää Ca²⁺ottaminen SR:ään. Toisin kuin PLN ja SLN, jotka ilmentyvät hiirten sydämessä ja hitaassa luustolihaksessa, MLN ekspressoituu voimakkaasti kaikissa luustolihaksissa. MLN:n geneettinen deleetio hiirissä lisää Ca²⁺käsittely luustolihaksissa ja parantaa harjoituksen suorituskykyä. Nämä havainnot tunnistavat MLN:n tärkeäksi luurankolihasten fysiologian säätelijäksi ja korostavat mahdollisuutta, että lisämikropeptidejä koodataan monissa RNA:issa, jotka tällä hetkellä merkitään koodaamattomiksi.

Sytosolinen kalsiumpitoisuus ([Ca²⁺]_c) on perustavanlaatuinen monien soluprosessien, kuten aineenvaihdunnan, proliferaation, lihasten supistumisen, solujen signaloinnin ja insuliinin erityksen säätelylle. Lepo-olosuhteissa sarko/endoplasminen verkkokalvo (ER/SR) Ca²⁺ATPaasin (SERCA) kuljetus Ca²⁺sytosolista ER- tai SR-onteloon säilyttäen lepotilan [Ca²⁺]_cnoin 25-100 nM. SERCA2-proteiinin vähentynyttä aktiivisuutta ja ilmentymistä on kuvattu sydämen vajaatoiminnassa ja diabeettisessa kardiomyopatiassa, mikä johtaa muuttuneeseen Ca-tasoon.²⁺käsittely ja sydämen supistumiskyky. Diabeettisessa haimassa on raportoitu SERCA2b:n ja SERCA3:n ilmentymisen vähenemistä β-soluissa, mikä on johtanut vähentyneeseen insuliinin eritykseen. Eri diabetesmalleista saadut todisteet ovat ehdottaneet roolia edistyneen glykaation lopputuotteiden muodostumisessa, oksidatiivisessa stressissä ja lisääntyneessäO- GlcNAsylaatio alentuneessa SERCA2-ekspressiossa, joka havaittiin diabeettisessa kardiomyopatiassa. SERCA2:n alasäätelyn roolia diabeteksen ja diabeettisen kardiomyopatian patofysiologiassa ei kuitenkaan ole vielä kuvattu hyvin. Tässä katsauksessa teemme kattavan analyysin nykyisestä tiedosta SERCA-pumppujen roolista insuliinista riippuvaisen diabetes mellituksen tyypin 1 (TIDM) ja tyypin 2 (T2DM) patofysiologiassa sydämessä ja β-soluissa haimassa. .

Respiratory Physiology & Neurobiology, osa 219, 2015, s. 43-50

European Journal of Pharmacology, osa 735, 2014, s. 68–76

Olemme analysoineet suuren johtavuuden kalsiumaktivoidun kaliumkanavan (BK) stimulaation vaikutukset ihmisen virtsarakon neurogeeniseen ja myogeeniseen supistukseen terveillä koehenkilöillä ja potilailla, joilla on virtsaamisoireita, ja arvioineet BK:n aktivoinnin tehokkuuden lievittämiseksi virtsarakon yliaktiivisuutta rotilla. Virtsarakkonäytteet otettiin elinluovuttajilta ja miehiltä, ​​joilla oli hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH). Sähkökenttästimulaation (EFS) ja karbakolin (CCh) aiheuttamia supistuksia arvioitiin eristetyissä rakkoliuskoissa. in vivo kystometriset tallenteet saatiin nukutetuissa rotissa kontrollissa ja etikkahapon aiheuttamissa hyperaktiivisissa olosuhteissa. Ihmisen virtsarakon neurogeeniset supistukset tehostivat BK:n ja pienen johtavuuden kalsiumaktivoitujen kaliumkanavien (SK) esto, mutta kalsiumaktivoitujen kaliumkanavien (IK) salpaus ei vaikuttanut niihin. EFS-indusoidut supistukset inhiboivat BK-stimulaatiolla NS-8:lla tai NS1619:llä tai SK/IK-stimulaatiolla NS309:llä (3 uM). BK:n, IK:n tai SK:n salpaus tai stimulaatio ei muuttanut CCh:n aiheuttamia supistuksia. Antikolinerginen aine, oksibutyniini (0,3 uM) esti joko neurogeenisiä tai CCh:n aiheuttamia supistuksia. BPH-potilaiden virtsarakon neurogeeniset supistukset olivat vähemmän herkkiä BK-estämiselle ja herkempiä BK-aktivaatiolle kuin terveet rakot. BK-aktivaattori NS-8 (5 mg/kg; i.v.) käänsi etikkahapon indusoiman virtsarakon hyperaktiivisuuden rotilla, kun taas oksibutyniini oli tehoton. NS-8 ei vaikuttanut merkittävästi verenpaineeseen tai sykeen. BK-stimulaatio estää erityisesti neurogeenisiä supistuksia potilailla, joilla on virtsaamisoireita, ja lievittää virtsarakon hyperaktiivisuutta in vivo vaarantamatta virtsarakon supistumiskykyä tai kardiovaskulaarista turvallisuutta, mikä tukee sen mahdollista terapeuttista käyttöä virtsarakon yliaktiivisuuden lievittämiseen.

Urology, osa 84, numero 2, 2014, s. 491.e1-491.e6

European Journal of Pharmacology, osa 814, 2017, s. 216–225

Cyclic Nucleotide Gated (CNG) -kanavat ovat ei-selektiivisiä kationikanavia, jotka välittävät solunulkoisen Na-virtauksen⁺ja Ca²⁺erilaisissa solutyypeissä. L-cis-Diltiatseemi, CNG-kanavan salpaaja, estää virtsaputken sileän lihaksen (USM) supistumista, mutta tämän vaikutuksen taustalla olevat mekanismit ovat edelleen epäselviä. Tutkimme mahdollisuutta, että CNG-kanavat myötävaikuttavat spontaanin sydämentahdistimen toimintaan juuri eristetyissä Cajalin (ICC) interstitiaalisissa soluissa, jotka on eristetty kanin virtsaputkesta (RUICC). Immunosytokemiaa käyttämällä havaitsimme voimakasta CNG1-immunoreaktiivisuutta vimentiini-immunoreaktiivisessa RUICC:ssä, pääasiassa solurungon ja prosessien laastareista. Sitä vastoin α-aktiinin immunoreaktiiviset sileät lihassolut (SMC) eivät osoittaneet merkittävää reaktiivisuutta spesifiselle CNGA1-vasta-aineelle. Juuri eristetty RUICC, jännite kiinnitettynä -60 mV:iin, kehitti spontaaneja ohimeneviä sisäänpäin suuntautuvia virtoja (STIC), joita L-cis-Diltiatseemi (50 µM) esti. Samalla tavalla L-cis-diltiatsemi (50 uM) inhiboi myös Ca²⁺aallot eristetyssä RUICC:ssä, tallennettu käyttäen Nipkow-pyörivälevykonfokaalimikroskooppia. L-cis-diltiatsemi (50 µM) ei vaikuttanut kofeiinin (10 mM) indusoimaan Ca²⁺ohimeneviä, mutta vähensi merkittävästi fenyyliefriinin aiheuttamaa Ca²⁺värähtelyt ja sisäänpäin suuntautuvat virrat RUICC:ssä. L-tyypin Ca²⁺virran amplitudi eristetyssä SMC:ssä pieneni ~18 % L-cis-diltiatseemin (50 uM) läsnä ollessa, mutta D-cis-diltiatsemi, tunnistettu L-tyypin Ca²⁺kanavasalpaaja, lakkautettu L-tyypin Ca²⁺nykyinen, mutta ei vaikuttanut Ca²⁺aallot tai STIC:t RUICC:ssa. Nämä tulokset osoittavat, että L-cis-diltiatseemin vaikutukset kaniinin USM:ään voivat välittyä CNG1-kanavien, jotka ovat läsnä virtsaputken ICC:ssä, estäminen, ja siksi CNG-kanavat myötävaikuttavat spontaanin aktiivisuuteen näissä soluissa.

Yleinen ja vertaileva endokrinologia, osa 213, 2015, s. 24–31

Veden nauttiminen juomalla on olennaista ionien homeostaasille merikaloissa. Nielty neste vaatii kuitenkin käsittelyä veden nettoimeytymisen mahdollistamiseksi suolistossa. Luminaalisten karbonaattiaggregaattien muodostuminen vaikuttaa kalsiumin homeostaasiin ja vaatii epiteelin HCO:ta₃⁻eritystä veden imeytymisen mahdollistamiseksi. Ottaen huomioon sen hormonaalisen merkityksen kalsiumin käsittelyssä ja osoituksen HCO:ssa₃⁻Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli paljastaa lisäkilpirauhashormoniin liittyvän proteiinin (PTHrP) rooli HCO:ssa₃⁻eritystä, veden imeytymistä ja säätelyäaqp1geenin ilmentyminen meriahvenen etusuolessa. HCO₃⁻eritys väheni nopeasti, kun PTHrP(1–34) lisättiin Ussing-kammioihin asennetun merilahnan etusuoleen. Vaikutus saavutti 60 %:n maksimieston peruserityksen nopeuksista, mikä osoittaa tehokkaan kynnysannoksen 0,1 ngml⁻¹yhteensopiva raportoitujen plasman PTHrP-arvojen kanssa. Käytettäessä yhdessä adenylaattisyklaasin estäjän (SQ 22.536, 100 μmoll) kanssa⁻¹) tai fosfolipaasi C:n estäjä (U73122, 10 μmoll⁻¹) PTHrP(1–34):n vaikutus HCO:hon₃⁻eritys väheni noin 50 % molemmissa tapauksissa. Samanaikaisesti suolistopusseista mitattu bulkkiveden absorptio oli herkkä PTHrP:n estämiselle. Estovaikutus noudattaa tyypillistä annos-vastekäyrää alueella 0,1–1000 ngml⁻¹, saavuttaa maksimivaikutuksen 60–65 %:n eston perusarvoista ja osoittaa merkittäviä kynnysvaikutuksia 0,1 ngml:n hormonitasoilla⁻¹. PTHrP:n vaikutus veden imeytymiseen poistui kokonaan adenylaattisyklaasin estäjän (SQ 22.536, 100 μmoll) läsnä ollessa⁻¹) ja oli epäherkkä fosfolipaasi C:n estäjille (U73122, 10 μmoll⁻¹).elääPTHrP(1–34) tai PTH/PTHrP-reseptoriantagonisti PTHrP(7–34) injektiot aiheuttivat vastaavasti merkittävän laskun tai lisääntymisenaqp1ab, mutta eiaqp1a. Kaiken kaikkiaan nykyiset tulokset viittaavat siihen, että PTHrP toimii keskeisenä säätelijänä karbonaattiaggregaattien muodostumiselle merikalojen suolistossa vaikuttamalla veden imeytymiseen, kalsiumin säätelyyn ja HCO:hon.₃⁻eritys.

Biochemical and Biophysical Research Communications, nide 484, numero 2, 2017, s. 456-460

Sarko(endo)plasmaverkko Ca²⁺-ATPaasi (SERCA) -pumput ovat integroituja kalvoproteiineja, jotka katalysoivat Ca:n aktiivista kuljetusta²⁺sarkoplasmiseen retikulumiin, mikä saa aikaan lihasten rentoutumisen. SERCA-pumput ovat erittäin herkkiä oksidatiivisille vaurioille, ja SERCA:n sytosuojaus vaimentaa lämpöinaktivaatiota ja on toteuttamiskelpoinen terapeuttinen strategia torjuttaessa sairauksia, joissa SERCA-aktiivisuus on heikentynyt, kuten lihasdystrofia. Tässä yritimme selvittää, voisiko tyydyttyneiden rasvahappojen (SFA) prosenttiosuuden lisääminen SERCAn lipidirenkaassa ruokavalion avulla suojata SERCA-pumppuja lämpöinaktivoitumiselta. Naaraspuolisille Wistar-rotille annettiin joko puolipuhdistettua kontrolliruokavaliota (AIN93G, 7 painoprosenttia soijaöljyä) tai modifioitua AIN93G-ruokavaliota, joka sisälsi runsaasti SFA:ta (20 painoprosenttia ihraa) 17 viikon ajan. Pohjalihakset uutettiin ja SERCA-lipidirengas ja aktiivisuus lämpörasituksen alaisena analysoitiin. Tuloksemme osoittavat, että SERCA:n lipidirenkaassa on runsaasti lyhytketjuisia (12–14 hiiltä) rasvahappoja, mikä vastaa hyvin SERCA:n ennustettua 21Å:n kaksoiskerroksen paksuutta. Kontrolliruokinnassa SERCA:n lipidirengas oli jo erittäin kyllästynyt (79 %), eikä runsasrasvainen ruokinta lisännyt sitä entisestään. Runsasrasvainen ruokinta ei lieventänyt lämpöstressin aiheuttamaa SERCA-aktiivisuuden vähenemistä; kuitenkin korrelaatioanalyysit paljastivat merkittäviä ja vahvoja assosiaatioita SFA-prosentin ja SERCA-aktiivisuuden lämpöstabiilisuuden välillä, jolloin suurempi SFA-prosentti liittyi alhaisempaan lämpöinaktivoitumiseen ja suurempi polytyydyttymättömyyden ja tyydyttymättömyysindeksin prosenttiosuus, joka liittyi lisääntyneeseen lämpöinaktivoitumiseen. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat, että SERCA:n lipidirengas voi vaikuttaa sen herkkyyteen oksidatiivisille vaurioille, millä voi olla vaikutuksia lihasdystrofiaan ja ikääntymiseen liittyvään lihasten häviämiseen.